Western一抗二抗去除液（強(qiáng)堿，劇烈型）

● 產(chǎn)品簡介：

Western一抗二抗去除液（強(qiáng)堿，劇烈型）(Western Antibody Stripping Buffer，basic，harsh type)可以高效去除印跡膜上的一抗和二抗，而吸附在膜上的抗原基本不受影響，用于Western中轉(zhuǎn)移了蛋白膜的重復(fù)利用，可以轉(zhuǎn)一次膜，做多次Western印跡實(shí)驗(yàn)，通常可以重復(fù)利用膜3-5（PVDF膜）。使用本試劑只需大約5-10分鐘（NC膜）或15-20分鐘（PVDF膜）即可實(shí)現(xiàn)蛋白膜的重復(fù)使用，然后可以進(jìn)行Western的后續(xù)操作。

該產(chǎn)品具有以下幾個優(yōu)點(diǎn)：

1.可用于昂貴或珍稀樣本的多次雜交；

2.有利于用不同抗體分析單次印跡上的不同蛋白，比如不同亞型的抗體；

3.有利于對異常結(jié)果進(jìn)行重新分析或確認(rèn)；

4.有利于糾正孵錯的抗體；

5.節(jié)約試劑成本，并節(jié)約時間。

各種去除液的選擇請點(diǎn)擊Western一抗二抗去除液選擇指南。

● 貯存：

   常溫貯存，有效期一年；常溫運(yùn)輸。

● 用前必讀：

1. 理想的抗體去除液應(yīng)該是洗脫抗體的同時，不洗脫膜上結(jié)合的蛋白或者不改變抗原的結(jié)合性質(zhì)，但是目前沒有一種去除液可以做到只洗脫抗體，而完全不洗脫膜上結(jié)合的抗原；也沒有一種去除液可以適用于所有不同親和度的抗原抗體復(fù)合物。去除液洗脫能力太強(qiáng)，抗原也容易被洗脫；太弱，則抗體殘留太高。因此，從免疫印跡膜上去除抗體的方案僅能用于定性用途，因?yàn)樵诿總€抗體清除循環(huán)中，或多或少都將洗去少量膜上的蛋白。

2. PVDF膜比硝酸纖維素膜（NC膜）更堅(jiān)韌，因此優(yōu)先推薦使用PVDF膜用于涉及抗體剝離的實(shí)驗(yàn)。

3. 從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)印完成后立即干燥PVDF膜或NC膜，可改善蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合，特別推薦用于涉及多次抗體剝離的實(shí)驗(yàn)。在第一輪抗體檢測之前，必須使用甲醇將干燥的PVDF膜潤濕或用1×TBST將干燥的NC膜潤濕。已經(jīng)結(jié)合有抗體的膜，決不能使得膜干燥，否則抗體分子將與膜結(jié)合緊密，很難剝離。因此，在做完一輪ECL發(fā)光檢測實(shí)驗(yàn)后，需要用清除液清除掉膜上的抗體，推薦將膜浸泡于1×TBS（非1×TBST）中4度保存。

4. 檢測時，優(yōu)先檢測低豐度抗原：先孵育條帶較弱（表達(dá)較低）的蛋白，再孵育條帶明顯（表達(dá)較高）的蛋白，最后再孵育內(nèi)參。

5. 如條件允許，下一輪的抗體雜交實(shí)驗(yàn)選擇種屬來源不同的一抗（對應(yīng)不同種屬的二抗），減少檢測的交叉反應(yīng)。

6. 該清除液適用于ECL發(fā)光檢測的膜上抗體清除，不適合于膜上直接顯色（DAB，BCIP/NBT等），不適合熒光檢測。

● 使用說明：

1. 在完成Western化學(xué)發(fā)光檢測后，NC膜或PVDF膜用適量蒸餾水中震蕩漂洗5分鐘；重復(fù)漂洗2次。

2. 棄蒸餾水，加入適量的Western一抗二抗去除液，在搖床上震蕩漂洗清除抗體。

孵育溫度和時間會明顯影響抗體去除效果，參照下表調(diào)整。

3. 棄去除液，加入足量蒸餾水，在搖床上漂洗2次，每次5分鐘，把去除液徹底漂洗干凈。

  注：殘余的去除液會影響后續(xù)抗原抗體的的結(jié)合。

4. 可選步驟：漂洗后的轉(zhuǎn)印膜孵育ECL發(fā)光液，檢測二抗的清除效率。曝光5分鐘，膜上看不到發(fā)光條帶表明二抗清除得比較干凈。如果膜上能看到條帶，重復(fù)步驟2-3。

5．繼續(xù)進(jìn)行Western的后續(xù)操作（封閉-抗體孵育-發(fā)光檢測）。

   注：建議每次膜剝離后都要進(jìn)行重新封閉，以降低背景。優(yōu)先選用5%脫脂奶粉（貨號：WN1070）封閉，推薦常溫封閉1小時；使用Western無蛋白快速封閉液（貨號：PF1070）時，NC膜需要封閉60分鐘；PVDF膜可以封閉10分鐘。

● 實(shí)驗(yàn)示例：

Western一抗二抗去除液（堿性，劇烈型）檢測效果圖

Western一抗二抗清除液（堿性，劇烈型）檢測效果圖

樣品：K562細(xì)胞，SDS裂解液（貨號：RL1060）提取總蛋白；

電泳：4-20% RealPAGE預(yù)制膠（貨號:RTD6117-0420）， 200 V 1×TGS  56 min

轉(zhuǎn)膜：NC膜，1×RealBlot快速轉(zhuǎn)膜液（貨號：RT5020）400 mA 40 min

圖1：5%脫脂奶粉封閉液（貨號：WN1070）  RT  60 min；一抗：Santa β-Actin鼠單抗（SC-47778） 1:2000  RT 60min；二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000（貨號：HGM1060）  RT 60min；ECL自動曝光3秒

圖2：膜加入Western一抗二抗清除液（堿性，劇烈型），第1次清除，常溫25度，搖床5 min，ECL自動曝光5分鐘，膜上二抗條帶去除干凈。

圖3：5%脫脂奶粉封閉液（貨號：WN1070），常溫?fù)u床60分鐘，PCNA 1:5000（貨號：APM5012）  RT 60min，羊抗鼠IgG-HRP 1:5000 （貨號：HGM1060）RT 60min，自動曝光11秒，β-actin和PCNA同時有條帶，說明圖二中actin一抗沒有完全去除干凈。

圖4：膜加入Western一抗二抗清除液（堿性，劇烈型），常溫24度 5 min第2次清除抗體，

Western無蛋白快速封閉液（貨號；PF1070）RT 60分鐘，一抗：Santa β-Actin鼠單抗（SC-47778） 1:4000 RT 60min，羊抗鼠IgG-HRP 1:5000（貨號：HGM1060）  RT 60min；ECL自動曝光6秒。

圖5：膜加入Western一抗二抗清除液（堿性，劇烈型）第3次清除 26度 5min，

一抗：Santa β-Actin鼠單抗（SC-47778） 1:4000  RT 60min；

二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000（貨號：HGM1060）  RT 60min；ECL自動曝光3分鐘。