RealPAGE plus彩色凝膠快速制備試劑盒
RealPAGE plus Colour Gel Fast Preparation Kit
● 貨品規(guī)格:
貨號(hào)
|
說(shuō)明
|
制膠數(shù)量
|
RTD6132-06
|
制備6%PAGE膠
|
125塊 0.75mm膠
>90塊1 mm膠
>60塊1.5 mm膠
|
RTD6132-08
|
制備8%PAGE膠
|
RTD6132-10
|
制備10%PAGE膠
|
RTD6132-12
|
制備12%PAGE膠
|
RTD6132-15
|
制備15%PAGE膠
|
● 貨品內(nèi)容:
組份
|
貨號(hào)
|
名稱
|
規(guī)格
|
保存
|
1
|
RTD6132-UA
|
上層膠溶液A
|
80 ml
|
4℃
|
2
|
RTD6132-UB
|
彩色上層膠溶液B
|
80 ml
|
4℃
|
3
|
RTD6132-LA06
|
下層膠溶液A 6%
|
250 ml
|
4℃
|
RTD6132-LA08
|
下層膠溶液A 8%
|
250 ml
|
4℃
|
RTD6132-LA10
|
下層膠溶液A 10%
|
250 ml
|
4℃
|
RTD6132-LA12
|
下層膠溶液A 12%
|
250 ml
|
4℃
|
RTD6132-LA15
|
下層膠溶液A 15%
|
250 ml
|
4℃
|
4
|
RTD6132-LB
|
下層膠溶液B
|
250 ml
|
4℃
|
5
|
RTD6132-SP
|
改良型促凝劑
|
8 ml
|
4℃,配制后-20℃貯存
|
|
|
說(shuō)明書
|
一份
|
|
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
該產(chǎn)品利用聚丙烯酰胺凝膠電泳原理,采用合理設(shè)計(jì)的預(yù)混合配方和配制流程,可在50分鐘內(nèi)配制得到高質(zhì)量的聚丙烯酰胺凝膠,用于變性和非變性蛋白凝膠電泳。本產(chǎn)品可以配制常用分離膠濃度6%、8%、10%、12%和15%,可以滿足絕大多數(shù)蛋白電泳需求。
本試劑盒大約可以配制60-125塊常規(guī)大?。?×10cm)PAGE凝膠,具體數(shù)量根據(jù)凝膠厚度決定:0.75mm厚度凝膠可以配制125塊膠,1mm厚度凝膠可以配制至少90塊膠,1.5mm厚度凝膠可以配制至少60塊膠。
● 運(yùn)輸和貯存:
本產(chǎn)品常溫運(yùn)輸;組份按照標(biāo)簽溫度貯存;有效期一年。
● 特點(diǎn):
1. 方便:彩色上層膠,方便上樣;上層膠和下層膠溶液1:1混合,無(wú)需計(jì)算;
2. 安全:不用接觸有毒粉末;不用單獨(dú)添加TEMED;
3. 兼容性廣:制膠溶液中不含SDS,可用于非變性電泳(Native-PAGE);
● 使用說(shuō)明:
一 凝膠制備:
1.1參照凝膠模具說(shuō)明書,裝配好凝膠模具。
1.2 根據(jù)下表參考選擇合適的凝膠濃度
表一不同濃度的PAGE下層膠的最佳分離范圍
下層膠(分離膠)濃度
|
最佳分離范圍
|
6%
|
50-350 kD
|
8%
|
35-300 kD
|
10%
|
20-150 kD
|
12%
|
15-100 kD
|
15%
|
10-80 kD
|
1.3 根據(jù)下表配制凝膠:
表二 凝膠配制表
下層膠配方
|
上層膠配方
|
膠厚度
|
下層膠溶液B
|
下層膠溶液A
|
改良型促凝劑
|
膠厚度
|
彩色上層膠溶液B
|
上層膠溶液A
|
改良型促凝劑
|
0.75 mm
|
2 ml
|
2 ml
|
40 μl
|
0.75 mm
|
0.5 ml
|
0.5 ml
|
10 μl
|
1.0 mm
|
2.5 ml
|
2.5 ml
|
50 μl
|
1.0 mm
|
0.75 ml
|
0.75 ml
|
15 μl
|
1.5 mm
|
4 ml
|
4 ml
|
80 μl
|
1.5 mm
|
1 ml
|
1 ml
|
20 μl
|
1.3.1 取等體積下層膠溶液B 和下層膠溶液A ,各 2.0/2.5/4.0 ml,混勻;
1.3.2混合溶液中加入 40/50/80 μl的改良型促凝劑,輕輕混勻,將混勻后的溶液注入制膠玻璃板中,使液面和短玻璃板上沿之間的距離比梳齒長(zhǎng)0.5 cm即可;
注意:此溶液為過(guò)量,請(qǐng)勿全部注入。
1.3.3 沿玻璃板緩慢加入適量滅菌水或無(wú)水乙醇覆蓋于下層膠之上,待下層膠凝固后,倒去上層水或乙醇;
注意:當(dāng)水(乙醇)和膠之間有一條折射線時(shí),說(shuō)明膠已凝固;25℃時(shí)5-10分鐘可以聚合。
1.3.4 取等體積彩色上層膠溶液B和上層膠溶液A ,各 0.5/0.75/1.0 ml,混勻;
1.3.5向混合溶液中加入 10/15/20 μl 的改良型促凝劑,輕輕混勻,插入梳齒;
1.3.6 待上層膠凝固后 (約20-40 min),拔去梳齒即可用于電泳。
注:凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí),聚合較快;冬天氣溫低時(shí),聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。
上層膠25℃ 20-25分鐘可以聚合;18℃ 35-40分鐘可以聚合。
二 電泳:
2.1 SDS-PAGE變性電泳:
2.1.1電泳緩沖液配制:
將5×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液干粉(自備,組份0.96 M 甘氨酸,0.125 M Tris,0.5% SDS)全部倒入1L燒杯中,加入約900 ml水徹底溶解,用水定容至1 L,即配成5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(此溶液不用調(diào)節(jié)pH值)。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
2.1.2 樣品處理:融化-混合-變性-上樣
5×MonoColor蛋白上樣緩沖液常溫?cái)?shù)分鐘解凍后輕輕搖勻,以確保溶液混合均勻;將緩沖液與蛋白樣品按照1:4的比例混勻,如8 μl樣品加入2 μl 5×上樣緩沖液;將蛋白樣品置于95℃中加熱5-10分鐘;蛋白樣品加入凝膠加樣孔內(nèi)電泳。
2.1.3 電泳過(guò)程;
在電泳槽的內(nèi)槽內(nèi)加入1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過(guò)加樣孔),輕輕的撥出梳子,用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔,隨后在電泳槽外槽加入適量的1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
表三 SDS-PAGE電泳條件
恒電壓
|
起始電流(一板膠)
|
結(jié)束電流(一板膠)
|
電泳時(shí)間
|
適用條件
|
150V
|
35-40 mA
|
15-20 mA
|
55 + min
|
最佳電壓,最優(yōu)的分辨率
|
200V
|
45-55 mA
|
20-25 mA
|
45+ min
|
節(jié)省時(shí)間
|
225V
|
40-50 mA
|
15-20 mA
|
35+ min
|
250V
|
65-75 mA
|
20-25 mA
|
30+ min
|
300V
|
70-80 mA
|
25-35mA
|
25+ min
|
最省時(shí)間
|
2.2 非變性電泳(Native PAGE):
2.2.1電泳緩沖液配制:
將5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液干粉(自備,組份0.96 M 甘氨酸,0.125 M Tris)全部倒入1L燒杯中,加入約900 ml水徹底溶解,用水定容至1 L,即配成5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(此溶液不用調(diào)節(jié)pH值)。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
2.2.2 樣品處理:融化-混合-上樣
5×非變性非還原蛋白上樣緩沖液常溫?cái)?shù)分鐘解凍后輕輕搖勻,以確保溶液混合均勻;將緩沖液與蛋白樣品按照1:4的比例混勻,如8 μl樣品加入2 μl 5×上樣緩沖液;蛋白樣品加入凝膠加樣孔內(nèi)電泳。注:非變性電泳樣品不能加熱處理。
2.2.3 電泳過(guò)程;
在電泳槽的內(nèi)槽內(nèi)加入1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過(guò)加樣孔),輕輕的撥出梳子,用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔,隨后在電泳槽外槽加入適量的1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液。
表四 Native PAGE電泳條件
|
恒電壓
|
起始電流
|
結(jié)束電流
|
電泳時(shí)間
|
適用條件
|
推薦電壓
|
150V
|
25-35/板膠
|
5-10 mA/板膠
|
60 + min
|
最佳電壓,最優(yōu)的分辨率
|
三. 染色:
1. 將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中,加入適量FastBlue蛋白染色液或常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色液(以剛剛覆蓋過(guò)膠面為適),條帶1-2分鐘即可見(jiàn)。
2. 搖床常溫?fù)u動(dòng)10-15分鐘至條帶清晰可見(jiàn)。
3. 加入適量蒸餾水脫色,期間更換1-2次蒸餾水,搖床常溫?fù)u動(dòng)10-15分鐘至背景干凈。
4. 觀察保存結(jié)果。
四. 實(shí)驗(yàn)示例: