2×GC Buffer
● 產(chǎn)品組成：
|
目錄號(hào)
|
規(guī)格
|
價(jià)格
|
|
RTB3101-01
|
1ml
|
|
|
|
|
|
|
RTB3101-03
|
10×1ml
|
300元
|
● 保存：-20℃
● 用途：
PCR 擴(kuò)增復(fù)雜結(jié)構(gòu)的 DNA 片段。
● 產(chǎn)品說(shuō)明和注意事項(xiàng)：
1. 本產(chǎn)品能與各種PCR酶配合使用，能夠擴(kuò)增具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)模板（GC rich、重復(fù)序列等）的PCR片段。
2. 使用 GC Buffer 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增時(shí)，建議使用 Tm 值較高的引物。因此，引物最好設(shè)計(jì)在 30 mer 左右。
3. 使用 GC Buffer擴(kuò)增的 GC rich 的DNA 片段長(zhǎng)度，會(huì)因 GC 含量不同而各有差異。
4. 由于 GC Buffer 和一般的PCR Buffer 相比 DNA 變性效果較強(qiáng)，因此，一般的 DNA片段（GC含量低于50%的目的片段）不推薦使用2×GC buffer進(jìn)行擴(kuò)增。
● 使用說(shuō)明：
1.
按照下表在0.2ml
PCR管中制備反應(yīng)體系：
|
成分
|
25μl反應(yīng)體系
|
50μl反應(yīng)體系
|
終濃度
|
|
Template
|
0.05-0.5 μg
|
0.1-1 μg
|
as you wish
|
|
Primer 1（10
μM）
|
0.5 μl
|
1 μl
|
200nM
|
|
Primer 2（10
μM）
|
0.5 μl
|
1 μl
|
200nM
|
|
2×GC buffer
|
12.5 μl
|
25 μl
|
1×
|
|
dNTP Mixture(10 mM)
|
0.5 μl
|
1 μl
|
200μM each
|
|
Taq (5 U/μl)
|
0.25-0.5 μl
|
0.5-1 μl
|
2.5-5U
|
|
ddH2O
|
up to 25 μl
|
up to 50 μl
|
-
|
2. 混勻后，離心快甩將反應(yīng)液收集到管底。
3. PCR儀如果沒(méi)有熱蓋加熱的話，補(bǔ)加25μl礦物油。
4. PCR儀上執(zhí)行以下程序：
兩步法：
|
步驟
|
溫度
|
時(shí)間
|
循環(huán)數(shù)
|
|
初始變性
|
94℃
|
5 min
|
1
|
|
變性
|
94℃
|
30 sec
|
25-40*
|
|
退火和延伸
|
68℃
|
1 min/kb
|
|
最后延伸
|
72℃
|
5 min
|
1
|
*注： PCR 反應(yīng)條件視模板、引物等的結(jié)構(gòu)條件不同而各異。在實(shí)際操作中需根據(jù)模板、目的片段的大小、堿基序列和引物的長(zhǎng)短等具體情況，設(shè)定最佳的反應(yīng)條件（溫度、時(shí)間等）。
1. 怎樣確定擴(kuò)增片段的GC含量大小？
推薦使用Oligo軟件分析片段的GC含量(如下圖所示)。
2.
2×GC
buffer能擴(kuò)增正常GC含量片段嗎？
2×GC
buffer可以擴(kuò)增GC含量正常的模板。然而，由于GC
buffer有比較強(qiáng)的變性效果，因此一般的模板使用GC buffer擴(kuò)增時(shí)，有時(shí)會(huì)降低擴(kuò)增效率。
3.
2×GC
buffer能兼容大多數(shù)PCR用酶嗎？
2×GC
buffer能兼容大多數(shù)PCR酶，比如Taq，Taq
plus，Long Taq等，可以根據(jù)片段長(zhǎng)度以及保真性要求選擇不同的酶。
4. 使用GC
buffer擴(kuò)增時(shí)，為什么推薦使用兩步法？
由于目的片段GC含量高，引物的Tm值往往會(huì)比較高，在PCR時(shí)，當(dāng)退火溫度和延伸溫度差距較小時(shí)，比如退火溫度超過(guò)60℃時(shí)，退火溫度和延伸溫度可以設(shè)成同一數(shù)值，一般為68℃。
2×GC buffer
lane 1-5: Rice 390bp fragement(GC% 77.1%)
lane 6-10: Rice 760bp fragement(GC% 72.9%)
lane 1 and 6: TaKaRa 2×GC buffer I
lane 2 and 7: TaKaRa 2×GC buffer II
lane 3 and 8: RTB3101 2×GC buffer
lane 4 and 9: RTB3106 10×Taq PCR buffer
lane 5: Rice 390bp，RTB3101 2×GC buffer, 三步法擴(kuò)增
lane 10: Rice 760bp，RTB3101 2×GC buffer, 三步法擴(kuò)增
