植物類囊體膜提取試劑盒         Ver.731075

● 產(chǎn)品簡介：

葉綠體（Chloroplast）是質(zhì)體的一種, 是高等植物和一些藻類所特有的能量轉(zhuǎn)換器，是光合作用的反應(yīng)場所。在高等植物中葉綠體象雙凸或平凸透鏡，長徑5~10μm，短徑2~4μm，厚2~3μm。高等植物的葉肉細(xì)胞一般含50～200個葉綠體，可占細(xì)胞質(zhì)的40%，葉綠體的數(shù)目因物種細(xì)胞類型，生態(tài)環(huán)境，生理狀態(tài)而有所不同。葉綠體由葉綠體被膜(chloroplast envelope)、類囊體(thylakoid)和基質(zhì)(stroma)三部分組成，含有3種不同的膜：外膜、內(nèi)膜、類囊體膜和3種彼此分開的腔：膜間隙、基質(zhì)和類囊體腔。類囊體膜上含有光合色素和電子傳遞鏈組分，光反應(yīng)在此上進(jìn)行，因此類囊體膜也稱光合膜。

本公司的植物類囊體膜提取試劑盒采用差速離心方法，可以從植物中提取到高純度的類囊體膜樣品。

1. 即用型試劑盒，用戶不需要單獨配制各種溶液。

2. 每次處理30 g葉片計算，本產(chǎn)品可使用8-10次提取，每次能得到8-10 mg左右類囊體膜樣品。

3. 已經(jīng)成功用于擬南芥，綠蘿，菠菜，豌豆，煙草等植物，還可用于更多植物（可能需要優(yōu)化條件）。

● 貯存及運輸：

4-8℃保存，至少一年有效；試劑盒常溫運輸。

● 產(chǎn)品組成：

● 使用說明：

注意：類囊體膜對溫度高度敏感，所以整個操作必須在冰上或者在冷室進(jìn)行，所用器皿和

溶液均需要在4℃預(yù)冷。離心時一定要在4℃進(jìn)行，離心力以g而不是rpm計算。如果需要研究類囊體膜的功能，提取過程還需要在昏暗的光線條件下進(jìn)行。

需要自備材料：

剪刀；50 ml尖底或圓底離心管；15 ml尖底或圓底離心管；勻漿機；低溫離心機。

1.1 材料預(yù)處理：

葉片在實驗前需先用自來水洗凈，再用蒸餾水淋洗，去掉多余水分。如果葉片采集后不能立即處理，則保存時需要保持葉片濕潤，即使如此，葉片采集后的放置時間也不能超過一天。

1.2  1×類囊體膜提取緩沖液（即用型）配制：

注：一個30克樣品提取反應(yīng)需要 120 ml 1×類囊體膜提取緩沖液（即用型）。

1.3 葉片勻漿：

1.3.1 新鮮采集植物葉片（約30克），快速去除葉脈并將葉片剪成1-3 cm²大小的碎片并浸泡在120 ml的預(yù)冷的1×類囊體膜提取緩沖液（即用型）中（每克葉片加4 ml）。

1.3.2 將浸泡了葉片的溶液轉(zhuǎn)移到電動勻漿機（即家用制備果汁的勻漿機，可選貨號：RT-2243A）中，低速勻漿5秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入勻漿機底部后，再低速勻漿5秒。注意：除電動勻漿機外，還可以選擇玻璃勻漿器和研磨（加玻璃珠）等裂解細(xì)胞的方法，但這些方法的單次處理量都比較小，需要將樣品分成很多小份單獨勻漿，然后再匯集。注：不要用液氮研磨，會損傷類囊體膜；不要過度勻漿，把葉片打碎即可，否則會降低類囊體膜得率。

1.3.3過濾勻漿液：2層過濾紙放于漏斗上，用漏斗將濾液收集到預(yù)冷的250 ml量筒中，一般分三次收集，總共可收集80-85 ml濾液，將濾液等分到4個預(yù)冷的50 ml的塑料離心管中（每個管中的濾液不要超過35 ml）。

1.4類囊體膜收集：

  4℃ 4200 g離心15分鐘，小心棄上清，沉淀即為類囊體膜。

1.5 類囊體膜漂洗：

1.5.1 在類囊體膜沉淀中加入1 ml 預(yù)冷的類囊體膜漂洗液，手彈離心管底部使沉淀重懸；再補加1 ml預(yù)冷的類囊體膜漂洗液，徹底重懸沉淀。

注：重懸時最好避免溶液起泡，手指輕彈，不要用槍頭吹打，否則容易損傷類囊體膜。

1.5.2  4度10000 g離心2分鐘，棄上清，保留沉淀。

1.6 類囊體膜重懸：

1.6.1  沉淀中加入1 ml的類囊體膜溶解液，手彈離心管底部使沉淀重懸；再補加1 ml預(yù)冷的類囊體膜溶解液，徹底重懸沉淀。

1.6.2  4℃10000 g離心2分鐘，上清為可溶性蛋白（根據(jù)實驗需要保留），沉淀為類囊體膜組分。

1.6.3 沉淀中加入1 ml類囊體膜溶解液，輕柔重懸沉淀，合并4管溶液，即為最終得到的類囊體膜溶液，約4 ml。

1.7 類囊體膜溶液定量：

通常類囊體膜蛋白含量用單位葉綠素含量來表示，即x μg 葉綠素/ml 類囊體膜溶液。

1.7.1 取5 μl 類囊體膜溶液加入到995 μl 80%丙酮溶液中，混勻。

1.7.2 10000 g 4℃離心2分鐘，吸取上清，測定OD₆₆₃和OD₆₄₆ 吸光值，用80%丙酮做空白對照。

1.7.3 根據(jù)以下公式計算葉綠素：

葉綠素濃度（μg Chl/ml）=200×（17.32×OD₆₄₆+7.18×OD₆₆₃） 注：200為稀釋倍數(shù)。

1.8 類囊體膜貯存：

將類囊體膜樣品用類囊體膜溶解液稀釋到濃度為1mg Chl/ml，根據(jù)需要適量分裝，如50 μl/管，-80℃保存。

1.9 類囊體膜樣品溶解和電泳：

類囊體膜增溶緩沖液配制：

將2.5 ml增溶緩沖液（2×）全部加入到增溶劑粉末中，加入滅菌水定容至5 ml，徹底混勻，即配成5 ml增溶緩沖液，適量分裝，-20℃貯存，盡量避免反復(fù)凍融。

1.9.1 取50 μl(濃度為1 mg Chl/ml)類囊體膜樣品, 4℃ 16000 g離心5分鐘，棄上清。

1.9.2 沉淀中加入50 μl類囊體膜增溶緩沖液重懸樣品（此時樣品濃度為1 mg Chl/ml），輕柔混勻，避免產(chǎn)生大量氣泡，冰浴10 min； 4℃ 16000 g離心15 min；上清為綠色，有微量沉淀。 注：如上清為無色，說明增溶不好。

1.10

 實驗示例：