動物膜蛋白提取試劑盒（細(xì)胞樣品）
(Animal
Membrane Protein Extraction Kit for Cells)
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產(chǎn)品貨號
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名稱
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規(guī)格
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RTD8111
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動物細(xì)胞膜蛋白提取試劑盒（細(xì)胞樣品）
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50次
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● 產(chǎn)品簡介
動物膜蛋白提取試劑盒（細(xì)胞樣品）(Animal
Membrane Protein Extraction Kit for Cells)提供了一種簡便的地從培養(yǎng)細(xì)胞或貼壁細(xì)胞中提取膜蛋白的方法。提取的膜蛋白不僅包括質(zhì)膜上的膜蛋白，也包括細(xì)胞器膜如線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和高爾基體膜上的膜蛋白。
本產(chǎn)品與許多用于分離膜蛋白的程序不同，該試劑盒不需要超聲，不需要耗時的超速離心，不使用去垢劑，最大限度地保持了膜蛋白在細(xì)胞內(nèi)的原始狀態(tài)。提取的基本原理是通過提取溶液和離心柱的協(xié)調(diào)作用提取得到高純度的膜蛋白。膜蛋白提取溶液可以溫和作用于細(xì)胞膜，改變細(xì)胞的滲透壓，然后在高速離心下細(xì)胞通過離心柱，這個過程中細(xì)胞膜會破裂；收集液700
g低速離心分離去除細(xì)胞核，因此消除了膜組分中細(xì)胞核組份的污染；隨后上清使用常規(guī)臺式低溫離心機（無需超速離心）16000
g高速離心，沉淀即為膜蛋白。
該產(chǎn)品約60分鐘即可完成培養(yǎng)細(xì)胞膜蛋白的提取。膜蛋白是在溫和、非變性條件下提取的，結(jié)合不同的溶解液，溶解后的膜蛋白可以用于SDS-PAGE變性電泳檢測、Blue
Native非變性電泳檢測以及等電聚焦電泳等。另外，膜蛋白也可以用于酶活性測定，免疫沉淀，ELISA測定等。
對于細(xì)胞樣品，如果每次使用細(xì)胞的數(shù)量為2-5×106，本試劑盒可以提取125個樣品；如果每次使用的細(xì)胞數(shù)量為1×107細(xì)胞，本試劑盒可以提取50個樣品。
● 產(chǎn)品組成
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序號
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產(chǎn)品編號
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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1
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RTD8111-01
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膜蛋白提取溶液
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25 ml
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4℃
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2
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PS1020
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變性蛋白溶解液
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5 ml
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RT
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3
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PN1020
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膜蛋白重懸液（BN電泳用）
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5 ml
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4℃
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4
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DM1080
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膜蛋白增溶液A
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5 ml
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4℃；
配制后-20℃貯存
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5
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PL130-01
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10×膜蛋白A型上樣緩沖液（配套膜蛋白增溶液A使用）
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1 ml
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4℃
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6
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CD-50
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離心柱套裝
（包含離心柱和2ml連蓋收集管）
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50個
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RT
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說明書
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-
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● 貯存、效期和運輸：
根據(jù)標(biāo)簽溫度貯存；一年有效；試劑盒常溫運輸。
● 用前必讀：
1. 離心機請調(diào)整成RCF/g模式，按照離心力設(shè)置離心機（不要根據(jù)轉(zhuǎn)速rpm模式設(shè)置），所有離心步驟都需要在4℃低溫離心機中進行。
2. 將膜蛋白提取溶液混勻后放置于冰上。將離心柱套入2 ml連蓋收集管中，蓋好管蓋，放置于冰上預(yù)冷。
3. 蛋白提取推薦添加蛋白酶抑制劑（自備，試劑盒不提供），根據(jù)蛋白酶抑制劑母液濃度提前添加在膜蛋白提取溶液中（如抑制劑母液是 100×，添加時按照1:100添加，即1ml膜蛋白提取溶液添加10μl抑制劑）。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自備，試劑盒不提供）。
4. 蛋白定量推薦使用BCA方法，可以選擇BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：RTP7102）。
● 使用方法：
一 培養(yǎng)細(xì)胞膜蛋白提?。?/b>
1.1 準(zhǔn)備溶液：
混勻膜蛋白提取溶液，立即放置在冰上。取適當(dāng)量的溶液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑（自備，試劑盒不提供），隨后立即放于冰上待用。按照下表大體估算膜蛋白提取溶液使用體積：
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細(xì)胞類型
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培養(yǎng)器皿
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細(xì)胞數(shù)量
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細(xì)胞沉淀體積（PCV）（μl）
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膜蛋白提取溶液（μl）
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懸浮細(xì)胞
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2-5×106
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20-50
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200
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5-10×106
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＞50
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500
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貼壁細(xì)胞
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96孔板
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~1×105
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調(diào)整細(xì)胞數(shù)目到2-5×106
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200
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24孔板
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~5×105
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調(diào)整細(xì)胞數(shù)目到2-5×106
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200
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6孔板
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~2.5×106
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~25
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200
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25cm2培養(yǎng)瓶
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~2×106
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~20
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200
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75cm2培養(yǎng)瓶
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~8×106
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~80
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500
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35
mm培養(yǎng)皿
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~2×106
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~20
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200
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60
mm培養(yǎng)皿
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~5×106
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~50
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500
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100
mm培養(yǎng)皿
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~1.5×107
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調(diào)整細(xì)胞數(shù)目到2-5×106
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200
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注：
(二百萬，2×106)HeLa細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀體積（PCM，Packed Cell Volume）大約為20 μl。
1.2 準(zhǔn)備細(xì)胞：
1.2.1
對于貼壁細(xì)胞：細(xì)胞用PBS漂洗一遍，棄PBS；再加入適量PBS，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，或用0.02%
EDTA（0.5
mM）溶液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細(xì)胞。400
g（~2000
rpm）
4℃離心5
min收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需提取的目的蛋白。
1.2.2
對于懸浮細(xì)胞：400
g（~2000
rpm）4℃離心5
min收集細(xì)胞，用PBS洗一遍，離心收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。
1.3 裂解細(xì)胞膜：
1.3.1細(xì)胞沉淀中加入準(zhǔn)備好的膜蛋白提取溶液（含蛋白酶抑制劑），用移液器吹打重懸細(xì)胞沉淀，渦旋劇烈震蕩30-60秒，冰浴處理10分鐘，間歇2-3混勻。
注：提取溶液使用推薦經(jīng)驗值：起始細(xì)胞數(shù)低于5×106加入
200 μl 提取溶液，起始細(xì)胞數(shù)量5×106-1×107加入500
μl提取溶液。如果細(xì)胞數(shù)目低于1×106或高于1×107，建議調(diào)整細(xì)胞數(shù)目在2-5×106范圍內(nèi)。
1.3.2
將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心柱中，蓋上管蓋，16,000
g（~13000
rpm） 4℃離心1分鐘，離心后收集管底部會有沉淀形成。
注：離心柱最大體積為600 μl；確保離心機可以在10秒內(nèi)達到16000 g。
1.3.3 棄去離心柱，蓋好2 ml收集管管蓋，用1ml移液器輕柔吹打重懸收集管中的沉淀。
1.4 去除細(xì)胞核：
溶液700 g（~2700 rpm）
4℃離心1分鐘，用200
μl吸頭小心將上清（上清稍有渾濁）轉(zhuǎn)移到新的1.5
ml離心管中。注意：轉(zhuǎn)速不要超過700g，否則會降低膜蛋白的得率。
關(guān)鍵步驟：吸取上清時不要觸及沉淀，甚至可以丟棄部分上清不吸取，以免上清（含膜蛋白）中污染核蛋白。如果使用200 μl提取溶液，建議吸取150 μl上清；使用500 μl提取溶液，建議吸取400 μl上清。此步驟得到的細(xì)胞核純度不高，混雜有沒有完全破碎的完整細(xì)胞，不建議用于相關(guān)實驗。
1.5 沉淀膜蛋白：
上清溶液16000
g（~13000
rpm）
4℃離心30分鐘，用200
μl吸頭吸棄上清，沉淀即為提取的膜蛋白。上清是胞漿蛋白，如需要可保存?zhèn)溆谩?
關(guān)鍵步驟：此步驟必須完全將上清吸取干凈，可以分次吸取上清，最后用10 μl吸頭將殘余上清徹底吸凈，以免膜蛋白中污染胞漿蛋白。
二 膜蛋白溶解：
膜蛋白沉淀可以根據(jù)下游實驗需求用50
μl相應(yīng)溶解液溶解。
注：不建議加入超過50
μl溶解液，會導(dǎo)致蛋白濃度偏低。
2.1 膜蛋白變性樣品處理：
2.1.1 建議使用50
μl變性蛋白溶解液（貨號：PS1020）溶解膜蛋白；
2.1.2 BCA方法測定蛋白濃度；
2.1.3用變性蛋白溶解液調(diào)整蛋白濃度為1
μg/μl，按需分裝，每管50
μl，-80℃保存待用；
2.1.4取一管50
μl樣品加入SDS-PAGE上樣緩沖液（貨號：PL080，PL113，PL121）處理，建議調(diào)整上樣液濃度為0.5
μg/μl；對于多次跨膜蛋白（Multi-pass
membrane protein）的變性電泳檢測，樣品建議使用37℃處理30分鐘或者70度處理10分鐘，不要95℃加熱5分鐘，因為在95℃高溫情況下，多次跨膜蛋白極易聚集形成多聚體，樣品會聚集，WB檢測會表現(xiàn)為比實際蛋白大小更大的分子量；
2.1.5
使用SDS-PAGE凝膠（貨號：RTD6132，RTD6116）電泳，每個泳道上樣10-40
μl（5-20
μg）。
2.2 膜蛋白BN非變性樣品處理：
2.2.1 建議使用50
μl膜蛋白重懸液（BN電泳用）（貨號：PN1020）重懸膜蛋白沉淀；
2.2.2 BCA方法測定蛋白濃度（貨號：RTP7102）；
2.2.3
用膜蛋白重懸液（BN電泳用）調(diào)整蛋白濃度為1
μg/μl，按需分裝，每管50
μl，-80℃保存待用；
2.2.4 取一管50
μl樣品，溶化混勻后4℃
16000 g 5分鐘，去除上清，保留沉淀；
2.2.5
沉淀中加入50
μl膜蛋白增溶液A（貨號：DM1080），輕柔重懸沉淀，盡量不產(chǎn)生氣泡，冰浴10分鐘；
膜蛋白增溶液A配制方法：在增溶劑粉末管中加入2.5 ml溶解緩沖液，加入超純水精準(zhǔn)定容至5 ml，徹底混勻，增溶液中DDM終濃度為1%。
2.2.6
4℃ 16000 g 15分鐘，取上清至一干凈1.5 ml離心管中即為增溶后膜蛋白溶液（小心不要吸取沉淀），此時得到的膜蛋白濃度為1
μg/μl，其中去垢劑DDM（n-Dodecyl
β-D-maltoside，β-DM n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度為1%；
2.2.7
膜蛋白溶液中加入1/10體積10×膜蛋白A型上樣緩沖液（配套膜蛋白增溶液A使用）（貨號：PL130），使用BN凝膠電泳（貨號：RTD6139，RTD6140），每個泳道上樣5-20
μg。
2.3 膜蛋白等電聚焦樣品處理（2D凝膠第一維電泳）：
建議膜蛋白沉淀中使用溶解液：7 M尿素,2
M硫脲,
2%CHAPS,20mM DTT(自備，試劑盒不提供)。
三 關(guān)于膜蛋白產(chǎn)量和質(zhì)量的評價：
3.1 膜蛋白產(chǎn)量：
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細(xì)胞系
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細(xì)胞數(shù)量
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膜蛋白
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K562
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1×107
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50-80 μg
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Jurkat
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1×107
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80-100 μg
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Hela
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1×107
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100-150 μg
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NIH-3T3
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1×107
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80-120 μg
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3.2 膜蛋白質(zhì)量評價：
膜蛋白質(zhì)量評價首先看提取的蛋白是否是膜蛋白，其次要看膜蛋白是否有明顯的富集，其三要看提出的膜蛋白是否有其他組分交叉污染，最后看提取的膜蛋白中是否可以檢測出目的蛋白。使用專門的膜內(nèi)參檢測（下表），可以初步確認(rèn)提出的是膜蛋白。膜蛋白是否有效富集需要用總蛋白作為對照，與總蛋白相比，膜蛋白中膜蛋白內(nèi)參是否有明顯富集。膜蛋白中的交叉污染可以用其他組分內(nèi)參檢測膜蛋白樣品，如關(guān)注膜蛋白中是否有細(xì)胞核蛋白污染，可以使用核蛋白內(nèi)參如Lamin
B1檢測膜蛋白，檢測無條帶即說明膜蛋白與細(xì)胞核組分無交叉污染。用目標(biāo)蛋白抗體檢測膜蛋白，驗證是否可以檢測到目的蛋白，蛋白大小是否符合預(yù)期。
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位置
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內(nèi)參名稱
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大小 kD
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細(xì)胞膜
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Na-K ATPase
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100
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內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜
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Calnexin
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~90
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線粒體膜
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COX IV
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17
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許多研究人員利用
WB對分離的膜蛋白進行純度檢測，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)一些常用的胞漿內(nèi)參能在膜蛋白中檢測到，例如β-actin[1],
GAPDH [2] 和 β-tubulin [3]，這是由于這些胞漿內(nèi)參不僅存在于胞漿也存在于質(zhì)膜中，因此可以在膜蛋白中檢測到胞漿內(nèi)參。更多信息，請參閱以下論文：
1.
Gruenstein E., et al. (1975). Actin
associated with membranes from 3T3 mouse fibroblast and Hela cells. Journal of cell Biology.
64:223-234.
2.
Terrasse R., et al. (2012). Human and
pneumococcal cell surface glyceraldehydes
-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) proteins are both ligands of human
C1q protein. J. Biol. Chem.
287:42620-42633.
3.
Wolff J. (2009). Plasma membrane tubulin. Biochemica
et BiophysicaActa. (BBA)-Biomembranes 1788:1415-1433.
四 實驗示例：
樣品：K562細(xì)胞，膜蛋白提取試劑盒提取膜蛋白（M）和胞漿蛋白（C），RIPA提取總蛋白（TP）
溫度處理：樣品與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（貨號：PL080）混合，37度處理30min，70度處理10min，95度處理5min
電泳：4-18% RealPAGE預(yù)制膠（貨號：RTD6119-0420），蛋白上樣量均為5
μg，恒壓200V 55min
轉(zhuǎn)膜：0.45μm PVDF膜，1×RealBlot轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號：RT5020）濕轉(zhuǎn)，恒流400
mA 35min。
封閉：快速封閉液（貨號：WR5020） RT 10
min
剝離：Western一抗二抗去除液（弱堿，溫和型）
（貨號：WS1200），37度搖床15
min
一抗：1 Na-K ATPase 1:5000；2
Calnexin 1:500；3 β-Tubulin 1:5000 ；4
β-Actin 1:10000；5 GAPDH 1:10000； 6 H3 1:10000；7
COXIV 1:5000；常溫?fù)u床孵育60min
二抗：羊抗兔IgG-HRP
1:5000（貨號：HGR1020），羊抗鼠IgG-HRP
1:5000（貨號：HGM1060），常溫?fù)u床孵育60min
檢測：ECL發(fā)光檢測（貨號：EC2520）