柱式動物胞漿蛋白提取試劑盒(細(xì)胞樣品,非變性提取,不含去垢劑)

(Column Animal Cells Native Protein Extraction Kit，Detergent-free)

● 產(chǎn)品簡介

蛋白提取過程中經(jīng)常使用去垢劑裂解細(xì)胞，如NP-40，Triton X-100，SDS等。然而這些去垢劑會對提取的蛋白后續(xù)功能研究產(chǎn)生影響。如去垢劑會影響蛋白的熒光標(biāo)記；高濃度的去垢劑會影響蛋白互作研究；陰離子去垢劑如SDS提取得到變性蛋白，不利于蛋白活性研究；含去垢劑的蛋白樣品能與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合，影響B(tài)lue Native電泳的分離效果。

本試劑盒采用不含去垢劑的裂解緩沖液，在低滲透壓條件下，使細(xì)胞充分膨脹，然后結(jié)合離心柱離心，有效破壞細(xì)胞膜，釋放出細(xì)胞內(nèi)蛋白，然后通過離心得到活性蛋白。另外，裂解緩沖液中也不含有還原劑如DTT和BME等，能有效保持蛋白的天然結(jié)構(gòu)。

對于細(xì)胞樣品，如果每個樣品的數(shù)量為5×10⁶個細(xì)胞，本試劑盒可以抽提50個樣品。

使用該產(chǎn)品提取的蛋白可以用于普通非變性電泳（Laemmli系統(tǒng)）（貨號：RTD6130，RTD6135）或Blue Native系統(tǒng)（貨號：RTD6140）。

注：由于提取緩沖液的適用性，本試劑盒主要提取得到的是胞漿內(nèi)的可溶性蛋白，對細(xì)胞膜蛋白，細(xì)胞器蛋白，細(xì)胞核蛋白提取效率不高，不建議使用。

● 產(chǎn)品組成

●  貯存、效期及運輸：

按照標(biāo)簽溫度貯存；有效期一年；常溫運輸。

● 用前必讀：

1. 離心機(jī)請調(diào)整成RCF/g模式，按照離心力設(shè)置離心機(jī)（不要根據(jù)轉(zhuǎn)速rpm模式設(shè)置），所有離心步驟都需要在4℃低溫離心機(jī)中進(jìn)行。

2. 溶液混勻后放置于冰上。將離心柱套入2 ml連蓋收集管中，蓋好管蓋，放置于冰上預(yù)冷。

3. 蛋白提取推薦添加蛋白酶抑制劑（自備，試劑盒不提供），根據(jù)蛋白酶抑制劑母液濃度提前添加在裂解緩沖液中（添加時按照1:100添加，即1ml裂解緩沖液 添加10 μl抑制劑）。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自備，試劑盒不提供）。

4. 蛋白定量推薦使用BCA方法，可以選擇BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：RTP7102）。

● 使用方法：

一 培養(yǎng)細(xì)胞活性蛋白提取：

1.1 即用型裂解緩沖液配制：

取適當(dāng)體積的預(yù)冷裂解緩沖液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入1/100體積的蛋白酶抑制劑（100×）（自備，試劑盒不提供），如果進(jìn)行蛋白磷酸化研究，需要加入1/100體積的磷酸酶抑制劑（100×）（自備，試劑盒不提供），隨后立即放于冰上待用（30分鐘內(nèi)使用）。

按照下表大體估算裂解緩沖液使用體積：

注： (二百萬，2×10⁶)HeLa細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀體積（PCV，Packed Cell Volume）大約為20 μl。

1.2 準(zhǔn)備細(xì)胞：

1.2.1 對于貼壁細(xì)胞：細(xì)胞用PBS漂洗一遍，棄PBS；再加入適量PBS，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，或用0.02% EDTA（0.5 mM）溶液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細(xì)胞。400 g（~2000 rpm） 4℃離心5 min收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。

1.2.2 對于懸浮細(xì)胞：400 g（~2000 rpm）4℃離心5 min收集細(xì)胞，用PBS洗一遍，離心收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。

1.3 裂解細(xì)胞膜：

1.3.1細(xì)胞沉淀中加入準(zhǔn)備好的裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），用移液器吹打重懸細(xì)胞沉淀，渦旋劇烈震蕩30-60秒，冰浴處理10分鐘，間歇2-3次混勻。

注：裂解緩沖液使用推薦經(jīng)驗值：起始細(xì)胞數(shù)低于5×10⁶加入 200 μl 裂解緩沖液，起始細(xì)胞數(shù)在5×10⁶-1×10⁷之間加入500 μl。如果細(xì)胞數(shù)目低于1×10⁶或高于1×10⁷，建議調(diào)整細(xì)胞數(shù)目在2-5×10⁶范圍內(nèi)。

1.3.2 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心柱中，蓋上管蓋，16,000 g（~13000 rpm） 4℃離心1分鐘，離心后可見收集管底部有沉淀形成。

     注：離心柱最大體積為600 μl；確保離心機(jī)轉(zhuǎn)速可以在1分鐘內(nèi)升速到16000 g。

   1.3.3 棄去離心柱，蓋好2 ml收集管管蓋，用1ml移液器輕柔吹打重懸收集管中的沉淀。

1.4 去除細(xì)胞核和未破碎的細(xì)胞：

將懸浮溶液16000 g（~13000 rpm） 4℃離心15分鐘。

1.5 收集上清：

收集上清即為胞漿蛋白，其蛋白濃度約為0.5-2 μg/μl，不同細(xì)胞略有不同。

關(guān)鍵步驟：吸取上清時不要觸及沉淀，甚至可以丟棄部分上清不吸取，以免上清中污染其他蛋白。

二 實驗示例：

2.1 電泳檢測：

5×10⁶ K562細(xì)胞，400g 3min收集，PBS漂洗一次；加500 μl 即用型提取緩沖液（含蛋白酶抑制劑），震蕩 60秒，冰浴10min；16000g 1min 過離心柱；重懸沉淀；4度 16000g 15 min，取上清即為胞漿活性蛋白。BCA測定蛋白濃度，蛋白得率2×10⁸細(xì)胞提取蛋白量約1.5 mg。BN電泳（右圖）：RTD6140 配制10% BN膠。使用 4×BN蛋白上樣緩沖液（貨號：PL114）調(diào)整上樣濃度為0.5μg/μl。1×藍(lán)色陰極電泳緩沖液 200V 50min，更換為1×無色陰極緩沖液，電泳時間共93min，F(xiàn)astBlue蛋白染色液染色。變性電泳（左圖）：RealPAGE 4-18%預(yù)制膠，用RIPA提取總蛋白（RIPA-TP）做對照樣品，使用 含BME上樣緩沖液調(diào)整上樣濃度為0.5μg/μl，200V 60min，F(xiàn)astBlue蛋白染色液染色。

2.2 WB檢測：

1 樣品：柱式動物胞漿蛋白提取試劑盒（RTD8106）提取K562總蛋白（活性提?。?；
            柱式動物總蛋白提取試劑盒（RTD8302）提取K562總蛋白（變性提?。?br /> 2 電泳：RealPAGE Tris-Gly預(yù)制膠4-15%,。非變性電泳：1×TG；變性電泳：1×TGS
3 轉(zhuǎn)膜：0.22μm NC膜；伯樂Turbo半干轉(zhuǎn)，濾布，一槽兩膠，RealBlot快速半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜緩沖液（RT5030），
             恒流2.5A 15min
4 封閉：Western快速封閉液（WR5020）快封10分鐘
5 一抗：β-Tubulin 1:5000(RGT2130)RT 60min；二抗-羊抗鼠IgG-HRP 1:5000(HGM1060) RT 60min
6 RealECL發(fā)光液(EC2520) 曝光1S
右圖：為同樣樣品變性電泳，同時轉(zhuǎn)膜，背靠背孵育.
結(jié)論：
1 β-Tubulin可以作為Tris-甘氨酸非變性系統(tǒng)的對照，結(jié)果為多種聚體。
2 柱式動物胞漿蛋白提取試劑盒（RTD8106）可以很好地非變性提取可溶性蛋白
3 RTD6137 440kD可以轉(zhuǎn)到膜上，作為分子量參照