碘化丙啶染色液（Propidium Iodide Staining Solution）

●  產(chǎn)品組成：

● 產(chǎn)品簡介：

碘化丙啶(propidium iodide，PI)，分子式C₂₇H₃₄I₂N₄ ，MW 668.39，CAS：25535-16-4。碘化丙啶不能穿過完整的活細胞膜，即正常細胞和凋亡細胞在不固定的情況下對PI拒染，而壞死細胞由于失去膜的完整性，PI可進入細胞內(nèi)與DNA結(jié)合，根據(jù)此特點，使用PI染色可鑒別死細胞。如果使用PI對活細胞染色必須在染色前進行固定，以增加細胞膜對染料的通透性。PI經(jīng)常被用來與 Calcein-AM 或者 FDA等熒光探針一起使用，能同時對活細胞和死細胞染色。 PI-DNA復合物的激發(fā)和發(fā)射波長分別為 535 nm 和615 nm。常用于流式細胞儀分析和顯微鏡觀察，檢測細胞凋亡(apoptosis)或細胞壞死(necrosis)。

本產(chǎn)品為 PI 水溶液，濃度為 1 mg/ml（1.5 mM）。使用時根據(jù)實驗不同直接將本產(chǎn)品用相應溶液稀釋到工作濃度。

● 貯存：

-20℃保存，一年有效。

● 操作步驟：

一 懸浮細胞染色

1.1 500 g（2400 rpm，下同）離心收集細胞樣品于1.5 ml離心管內(nèi)，加入0.5 ml固定液（貨號：KA5010，卡諾固定液），緩緩懸起細胞，常溫固定10分鐘或更長時間(可4℃過夜)。

1.2離心去盡固定液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘，洗滌期間手動晃動數(shù)次。

1.3 細胞沉淀中加入200μl 1×PBS重懸，加入10 μl 碘化丙啶染色液，37℃避光染色10-15分鐘，手動晃動數(shù)次。

1.4 離心收集沉淀，重懸于100 μl 1×PBS中。

1.5 取5 μl抗熒光淬滅封片液（貨號：AM0510）于載玻片上，加入等體積步驟1.4染色后細胞重懸液，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。

1.6 熒光顯微鏡下觀察可檢測到呈紅色的細胞核。激發(fā)波長為535 nm，發(fā)射波長為615 nm。

注：熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測。

二 貼壁細胞染色

2.1 取潔凈蓋玻片在70%乙醇中浸泡5分鐘或更長時間，無菌超凈臺內(nèi)吹干或用無菌的PBS洗滌三遍，再用細胞培養(yǎng)液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔板內(nèi)，種入細胞培養(yǎng)過夜，生長至50%-80%滿度。

2.2刺激細胞發(fā)生凋亡后，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 ml固定液，固定10分鐘或更長時間(可4℃過夜)。

2.3去盡固定液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。洗滌時宜用搖床或手動晃動。

2.4加入0.5 ml PBS，加入25 μl碘化丙啶染色液，37℃避光染色10-15分鐘，手動晃動數(shù)次。

2.5去盡染色液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。洗滌時宜用搖床或手動晃動。

2.6滴一滴抗熒光淬滅封片液（貨號：AM0510）于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，讓細胞接觸封片液，盡量避免氣泡。

2.7熒光顯微鏡下觀察可檢測到呈紅色的細胞核。激發(fā)波長為535 nm，發(fā)射波長為615 nm。

注：熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測。

● 實驗示例：

操作流程： 胰酶消化液消化，計數(shù)2×10⁶/ml