細(xì)胞膜紅色熒光染色試劑盒（DiI）

● 產(chǎn)品介紹：

細(xì)胞膜紅色熒光染色試劑盒(DiI)，Cell Plasma Membrane Staining Kit with DiI (Red Fluorescence)是一種以DiI為熒光探針，能夠快速靈敏地對細(xì)胞膜進行紅色熒光染色標(biāo)記的試劑盒。

DiI在進入細(xì)胞膜之前熒光非常弱，僅當(dāng)進入到細(xì)胞膜后才可以被激發(fā)出很強的熒光。DiI被激發(fā)后可以發(fā)出橙紅色的熒光，DiI和磷酯雙層膜結(jié)合后的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考上圖。其中，最大激發(fā)波長為549nm，最大發(fā)射波長為565nm。

本試劑盒如果用于流式細(xì)胞儀，每個樣品的檢測體系體積為0.5 ml時，可以進行200次檢測；96孔板每孔檢測體系的體積為100 μl時可以進行1000次檢測。

● 產(chǎn)品組成：

● 貯存：

DiI（400×） -20℃避光保存，一年有效。染色緩沖液可以4℃貯存。

● 使用說明：

1. 細(xì)胞膜染色工作液制備：

細(xì)胞膜染色工作液的用量：對于6、12、24、96孔板，每孔的細(xì)胞膜染色工作液分別為1~2ml、0.5~1ml、300~500μl和50~100μl；對于流式細(xì)胞樣品，每個樣品的細(xì)胞膜染色工作液為0.5ml；對于切片，可以根據(jù)切片大小，每個切片使用100-200μl的細(xì)胞膜染色工作液。

注：不同細(xì)胞的最佳染色濃度略有不同，細(xì)胞膜染色工作液的最終濃度建議根據(jù)不同細(xì)胞系和實驗體系進行優(yōu)化，可在1:100-1:400之間進行調(diào)整。

2. 懸浮活細(xì)胞染色：

2.1 加入適當(dāng)體積的細(xì)胞膜染色工作液重懸細(xì)胞，使其密度為1×10⁶/ml左右。

2.2 37℃避光孵育細(xì)胞5-20 min，不同的細(xì)胞最佳孵育時間不同。以5 min作為初始孵育時間，根據(jù)實際所用的細(xì)胞優(yōu)化染色時間，以得到最佳的熒光染色效果。

2.3 500×g常溫離心5 min。

2.4 吸除上清液，緩慢加入37℃預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。

2.5 用細(xì)胞培養(yǎng)重復(fù)漂洗沉淀一次。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測，或?qū)⒓?xì)胞封片觀察，封片時請避免使用含有甘油或其它有機物的封片劑，否則會影響染色并增加熒光背景，可以直接用PBS封片，在熒光顯微鏡下觀察。

3. 貼壁活細(xì)胞染色：

3.1 將貼壁細(xì)胞種于細(xì)胞培養(yǎng)皿、多孔細(xì)胞培養(yǎng)板或者細(xì)胞爬片上。

3.2 吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2次。

3.3 加入適當(dāng)體積的細(xì)胞膜染色工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞。

3.4 37℃避光孵育細(xì)胞5-20 min，不同的細(xì)胞最佳培養(yǎng)時間不同。以5min作為初始孵育時間，根據(jù)實際所用的細(xì)胞優(yōu)化染色時間，以得到最佳的熒光染色效果。

3.5 吸除細(xì)胞膜染色工作液，用PBS洗滌2次，然后加入37℃預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液即可在熒光顯微鏡下觀察。

4. 固定后細(xì)胞或切片的染色：

注：DiI不建議用于固定后細(xì)胞或組織的染色，因為細(xì)胞固定后影響了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，不能準(zhǔn)確反映熒光標(biāo)記位置。以下步驟僅供參考：

4.1. 使用4%多聚甲醛固定液進行固定。

4.2 吸除固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3遍。

4.3 使用配制在PBS中的0.1% Triton X-100進行通透，常溫10 min。然后用PBS洗滌細(xì)胞3遍。

4.4按照免疫染色的方法進行抗體的孵育或用其它染料進行染色。注意：抗體孵育步驟中的封閉液、抗體稀釋液及洗滌液不能含有去垢劑。

4.5加入適當(dāng)體積的細(xì)胞膜染色工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞或樣品。

4.6 37℃避光孵育5-20 min，最佳染色時間需要根據(jù)自己的實驗條件摸索，以達到最佳的熒光染色效果。

4.7吸除細(xì)胞膜染色工作液，用PBS洗滌2-3次，隨后即可在熒光顯微鏡下觀察。

● 實驗示例：

操作程序：293細(xì)胞調(diào)整密度1×10⁵/ml，接種到6孔板中，培養(yǎng)30小時；去除培養(yǎng)基，PBS漂洗一次；33342染色37度10分鐘，去除33342染色液，加1.5 ml PBS，觀察拍照（40×）（圖A）；去除PBS，DiI染色，37度10分鐘，去除DiI染色液，加1.5ml PBS，觀察拍照（40×）（圖B）