Tris緩沖液介紹

Tris-HCl緩沖液

注：原文為“龍師兄實(shí)驗(yàn)室”公眾號原創(chuàng)，略有修改。                                                

Ver 730464

在生化實(shí)驗(yàn)中，除了常用的PB和PBS緩沖液，還經(jīng)常用到THB和TBS緩沖液，那什么是THB和TBS？ THB是Tris-HCl Buffer的縮寫，中文翻譯為“Tris-鹽酸緩沖液”，依靠Tris(堿)和HCl(酸)對溶液起到緩沖維持溶液pH值的作用。實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常稱呼為Tris緩沖液或者Tris-HCl緩沖液，下文統(tǒng)一稱呼為Tris緩沖液。

TBS是Tris Buffered Saline 的簡寫，中文通常稱為“三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液”，更準(zhǔn)確地譯名應(yīng)該是“三羥甲基氨基甲烷緩沖生理鹽水”，是生化實(shí)驗(yàn)廣泛使用的一種緩沖溶液。通常是在THB的基礎(chǔ)上加入0.9% NaCl（0.15 M），擁有和人體體液類似的滲透壓。常用于清洗免疫染色的組織或Western Blotting中的蛋白印跡膜等。有時為了滿足其它需求，需加入Tween-20，這就是常用的TBST（TBS with Tween-20）緩沖液。

Tris的歷史：

Tris初次引起廣泛注意的商業(yè)成功之一是在魚的運(yùn)輸時降低了魚的死亡率。在20世紀(jì)40年代，活魚是在盛有海水的桶里運(yùn)往市場的。不幸的是，許多魚因CO₂的積聚使pH下降而致死。為了解決這個問題，在水中加入麻醉劑以便使魚的代謝活動降至最低限度，即使這樣也只能部分地得到緩解。1958年，McFarland和Norris在海水中加入Tris穩(wěn)定其pH，的確降低了魚的死亡率。Tris有很高的緩沖能力，在水中溶解度高，對很多酶反應(yīng)是惰性的，Tris也成了用于許多生化目的非常滿意的緩沖液，也是目前用于分子克隆中大多數(shù)酶反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液。

緩沖pH范圍:

Tris為弱堿，在常溫（25℃）下，它的pKa為8.1，根據(jù)緩沖理論，Tris緩沖液的有效緩沖范圍在pH 7.1到9.1之間。0.1 M的水溶液pH為10.4，一般加入鹽酸以調(diào)節(jié)pH值，即可獲得所需pH值的緩沖液。但同時應(yīng)注意溫度對于Tris的pKa的影響對于 Tris 緩沖液，溫度每降低 1℃，pH 增加約0.03 個單位，濃度每稀釋 10 倍，pH 降低 0.03-0.05 個單位。對于精確應(yīng)用，使用帶有玻璃/甘汞復(fù)合電極的經(jīng)仔細(xì)校正的 pH 計。

Tris緩沖液的優(yōu)點(diǎn)：

1.Tris為弱堿，可以只用一種緩沖體系配制pH范圍由酸性到堿性的大范圍pH值的緩沖液，應(yīng)用范圍廣。

2. Tris緩沖液對生物化學(xué)過程干擾很小，不與鈣、鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。

3. Tris在水中溶解度高，對很多酶的反應(yīng)是惰性的。

4. Tris緩沖能力高，在pH7.5-9.0之間有較強(qiáng)的緩沖能力。

5. Tris緩沖劑應(yīng)用廣，在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、體外診斷、化妝品、涂料等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

Tris緩沖液的缺點(diǎn)：

1.在常溫（25℃）下，Tris的pKa為8.1；根據(jù)緩沖理論，Tris緩沖液的有效緩沖范圍在pH7.1到9.1之間。實(shí)際操作中，在pH值小于7.5和大于9.0時，Tris的緩沖能力是非常低的。

2.Tris緩沖液的pH值受溫度影響大，△pKa/℃＝-0.031 ，例如：4℃時緩沖液的pH=8.4，則37℃時的pH=7.4，所以一定要在使用溫度下進(jìn)行配制，室溫下配制的Tris-HCl緩沖液不能用于0-4℃。

3.濃度對Tris解離有顯著影響。例如，10 mM和100 mM Tris溶液的pH值會相差0.1pH單位，溶液的濃度越大則其pH值越高。

4.Tris作為伯胺，在一定程度上與各種分子反應(yīng)，包括RNA酶抑制劑，醛，酶，DNA以及常見金屬如Cr²⁺，F(xiàn)e³⁺，Ni²⁺，Co²⁺和Cu²⁺等，在有些系統(tǒng)中會起抑制作用，在配制過程中需考慮與其他組分之間的相互作用。

5. Tris緩沖液易吸收空氣中的CO₂，配制的緩沖液要注意蓋嚴(yán)密封。

6. Tris與許多類型含有亞麻纖維接頭的pH電極起反應(yīng)，這種影響表現(xiàn)在電動勢(emf)漂移，平衡時間加長。因此，具有亞麻纖維接頭的電極不能精確測定Tris溶液的pH值。只能使用具有陶瓷或玻璃接頭的電極測定Tris溶液的pH值。

7. Tris對許多哺乳動物有毒性。吸入、攝入、皮膚吸收Tris可造成傷害，操作時需戴好手套和護(hù)目鏡；

8. 作為蛋白緩沖液時，若后續(xù)工作需要質(zhì)譜，則不適宜用Tris，需換成其他質(zhì)譜儀可耐受的緩沖液。

各種與Tris相關(guān)緩沖液的配制方法:

一、1×TBS的配制

1× TBS ( pH7.4 ) 的配制（0.02 M Tris，0.15 M NaCl，pH7.4）：2.4 g Tris ( 三羥甲基胺基甲烷 )，8.76 g NaCl ，950 ml超純水， 磁力攪拌下滴加濃HCl至pH為7.4，再加超純水定容至1000 ml，即可。如需含0.1% Tween-20，則在滴加HCl前先加入1ml Tween-20。

二、THB的配制

Tris-HCl緩沖液的兩種配置方法：

第一種方法是用Tris-HCl粉末（MW 157.6）和Tris粉末（MW 121.14）按照不同比例混合，用水溶解即配成不同pH的Tris-HCl緩沖液。

另外一種方法是只用Tris粉末，用鹽酸調(diào)節(jié)需要的pH值：以配置1 L 0.1 M的Tris-HCl緩沖液為例：先稱12.11 g Tris堿溶于950 mL超純水中，邊攪拌邊滴加濃鹽酸，用pH計測定溶液所需的pH值，然后再加水補(bǔ)足到1 L即可。

配制50 mM Tris-HCl緩沖液 1升配制方法：

溫度對 50 mM Tris-HCl液pH值的影響

三、TBST緩沖液

TBST是TBS + Tween的縮寫，含有Tris-HCl，NaCl，Tween-20，是做Western Blot常用的一種洗膜緩沖液，1×TBST濃度為0.02 M Tris，0.15 M NaCl，0.1% Tween-20，pH7.4。WB實(shí)驗(yàn)中，為了防止曝光圖背景太高，在孵育時，混有Tween 的TBST 能洗掉PVDF膜上非特異性吸附的蛋白質(zhì)。Tween是一種離子表面活性劑，有復(fù)性抗原作用，可提高抗體特異性結(jié)合。TBST緩沖液于室溫儲存，若溫度過低，會產(chǎn)生沉淀，可溶解或加熱后使用。

四、TE緩沖液

TE緩沖液是Tris-HCl緩沖液 + EDTA，1×TE濃度為10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA pH8.0。為使用方便，TE緩沖液也可以配成10×或50×濃度。TE緩沖液是弱堿性，對DNA的堿基有保護(hù)作用，因此，DNA在TE中的穩(wěn)定性較好，不易被破壞完整性或產(chǎn)生開環(huán)及斷裂，TE緩沖液被用于DNA的穩(wěn)定和儲存。

五、TAE緩沖液

TAE緩沖液是將TE緩沖液中的鹽酸換成乙酸（Tris/Acetate/EDTA），50×TAE濃度為2 M Tris-醋酸，100 mM EDTA，~pH8.5。TAE是使用最廣泛的緩沖系統(tǒng)。其特點(diǎn)是超螺旋電泳時更符合實(shí)際相對分子質(zhì)量，且雙鏈線狀DNA在其中的遷移率較快，電泳大于13 kb的片段時用TAE緩沖液將取得更好的分離效果，此外，回收DNA片段時也建議用TAE緩沖系統(tǒng)進(jìn)行電泳。但是，TAE的缺點(diǎn)是緩沖容量弱，長時間電泳不建議使用。

六、TBE緩沖液

TBE緩沖液是將TE緩沖液中的鹽酸換成硼酸（Tris/Borate/EDTA），5×TBE濃度為445 mM Tris-硼酸，10 mM EDTA，~pH8.3。TBE緩沖液常用于丙烯酰胺電泳以及瓊脂糖凝膠電泳。TBE可用于長時間電泳，對較小片段分離效果較好。但是，超螺旋在TBE緩沖液中電泳時測出的相對分子質(zhì)量會稍大于實(shí)際分子質(zhì)量。另外，有文獻(xiàn)報道，硼酸會影響DNA的連接，如果要進(jìn)行凝膠回收的話，盡量不使用TBE緩沖液。